內(nèi)源性AMPA型gu氨酸受體（AMPAR）活細(xì)胞成像試劑

LiveReceptor AMPAR

LiveReceptor AMPAR是一種可以在活細(xì)胞中對AMPA型gu氨酸受體（AMPA Receptor; AMPAR）進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記的蛋白標(biāo)記試劑。由于它能在活細(xì)胞中對內(nèi)源性AMPAR進(jìn)行標(biāo)記，所以通過活細(xì)胞成像技術(shù)對生理性AMPAR進(jìn)行行為分析的能力十分優(yōu)秀。

※ 本產(chǎn)品是Funakoshi株式會社基于京都大學(xué)工學(xué)研究科 浜地教授的研究成果商品化而成。

※ 本產(chǎn)品僅供研究，研究以外不可使用。

添加LiveReceptor AMPAR至初代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，可用熒光素對內(nèi)源性AMPAR進(jìn)行標(biāo)記。使用LiveReceptor AMPAR，可使活神經(jīng)細(xì)胞中的AMPAR可視化。

◆關(guān)于受體活細(xì)胞成像方法的問題以及配體指向性蛋白標(biāo)記

■ 傳統(tǒng)受體的成像方法及問題

配體指向性蛋白標(biāo)記

為了克服過往的問題，京都大學(xué)工學(xué)研究科的浜地教授與清中準(zhǔn)教授等人，確立了一項(xiàng)技術(shù)，利用蛋白表面反應(yīng)基團(tuán)酰基咪唑（acyl imidazole）僅對內(nèi)源性目標(biāo)受體蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記（圖下半部分）。該方法只有在特異性配體與目標(biāo)受體蛋白結(jié)合時，激活蛋白表面的反應(yīng)基團(tuán)酰基咪唑，可以選擇性對目標(biāo)受體蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記。由于接下來更換培養(yǎng)基可以去除多余配體和反應(yīng)片段，因此可以觀察到配體結(jié)合部位呈現(xiàn)空余狀態(tài)的生理性受體蛋白行為。

參考文獻(xiàn)：

1. Fujishima, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3961～3964 (2012).

2. Miki, et al., Chem. Biol., 21, 1013～1022 (2014).

■ LiveReceptor AMPAR

LiveReceptor是以神經(jīng)遞質(zhì)受體為目標(biāo)的配體指向性蛋白標(biāo)記試劑。LiveReceptor AMPAR是一種AMPA型gu氨酸受體（AMPAR）特異性熒光標(biāo)記試劑¹。它對闡明在記憶分子機(jī)制中發(fā)揮核心作用的AMPAR行為分析有用，并且作為腦神經(jīng)基礎(chǔ)研究為首的神經(jīng)、精神疾病研究等治療藥物開發(fā)的試劑備受期待。

參考文獻(xiàn)

1. Wakayama, et al., Nat. Commun., 8, 14850 (2017). [PMID : 28387242 ]Chemical labeling for visualizing native AMPA receptors in 

1. live neurons.

※ LiveReceptor AMPAR為文獻(xiàn)中的CAM(FI)。

◆特點(diǎn)

●　可以在內(nèi)源性AMPAR標(biāo)記熒光素。

●　AMPAR(Glu2-4亞單位)特異性高*，不會標(biāo)記其他離子通道gu氨酸受體（NMDA行gu氨酸受體、海藻酸gu氨酸受體）。

●　添加培養(yǎng)基， 1~4小時的標(biāo)記反應(yīng)后，便可進(jìn)行AMPAR實(shí)時成像。

●　由于沒有膜滲透性，因此僅可標(biāo)記細(xì)胞表面的AMPAR。

●　在過量表達(dá)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、培養(yǎng)大腦切片組織以及AMPAR（GluA2、GluA3A或者GluA4亞基）的細(xì)胞系上有應(yīng)用案例。

●　由于是小分子，組織滲透性高，在腦組織急性切片上有可以標(biāo)記至深部的應(yīng)用案例。

●　經(jīng)電生理學(xué)方法確認(rèn)，標(biāo)記后的AMPAR仍然保持離子通道功能。

●　推薦使用濃度1 μM，這個濃度下幾乎沒有細(xì)胞毒性。

●　由于使用熒光素用作熒光色素，所以有pH反應(yīng)，并且內(nèi)部化的標(biāo)記AMPAR趨于淬滅。因此適于觀察細(xì)胞表面的AMPAR。

●　以活細(xì)胞成像為首，可用于各種應(yīng)用。詳情請瀏覽下文應(yīng)用實(shí)例

*由于不會標(biāo)記GluA1亞基，所以不能使GluA1同聚物可視化。

◆應(yīng)用

●　活細(xì)胞成像

●　Western blot（抗熒光素抗體）

●　通過免疫沉淀（抗熒光素抗體）對AMPAR結(jié)合蛋白進(jìn)行分析、研究

●　免疫染色（可以與抗其他因子的抗體進(jìn)行共染色）

●　拮抗型抑制物質(zhì)的探索以及活性評價

◆應(yīng)用實(shí)例

神經(jīng)細(xì)胞的活體成像

添加1 μM LiveReceptor AMPAR及熒光標(biāo)記配體（FL-ligand；陰性對照）至原代海馬神經(jīng)細(xì)胞中培養(yǎng)30 min，換液后進(jìn)行實(shí)時成像。熒光標(biāo)記配體無法觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)；與之相反，使用LiveReceptor AMPAR可以觀察到神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)以及樹突棘結(jié)構(gòu)。

培養(yǎng)切片組織的實(shí)時成像

海馬的培養(yǎng)切片組織中，分別在含有和不含AMPAR特異性拮抗阻遏物NBQX（10 μM）的情況下，添加Live Receptor AMPAR（1 μM）。培養(yǎng)1小時，換液后進(jìn)行實(shí)時成像。

不含NBQX（左）：可觀察到樹突棘結(jié)構(gòu)的熒光信號。

含有AMPAR特異性阻遏物NBQX（右）：熒光信號消失。

結(jié)果顯示，NBQX與 AMPAR配體的結(jié)合部位相互競爭，以及LiveReceptor AMPAR的熒光信號是AMPAR特異性的。

AMPAR特異性

A：特異性驗(yàn)證

用LiveReceptor AMPAR導(dǎo)入熒光素后，裂解細(xì)胞，以抗熒光素抗體（anti-FL）進(jìn)行Western blot進(jìn)行檢測，獲得了相當(dāng)于AMPAR的GluA2亞基的105 kDa的單條帶。從該條帶AMPAR特異性抑制物質(zhì)NBQX消失來判斷AMPAR特異性。

B：利用免疫沉淀證明其特異性

為鑒定通過LiveReceptor AMPAR 進(jìn)行熒光素標(biāo)記的蛋白，不使用抗熒光素抗體（anti-FL）進(jìn)行免疫沉淀，而是使用對各gu氨酸受體亞基的特異性抗體進(jìn)行Western blot。結(jié)果只發(fā)現(xiàn)AMPA型gu氨酸受體的亞基GluA2濃縮，其余GluN（NMDA型gu氨酸受體：NMDAR）和GluK（海藻酸型gu氨酸受體：KAR）并未發(fā)現(xiàn)免疫沉淀引起的濃縮。

C：利用免疫染色比較抗GluA抗體染色圖像

利用LiveReceptor AMPAR在活細(xì)胞進(jìn)行熒光素標(biāo)記后，固定細(xì)胞，使用抗GluA2抗體進(jìn)行免疫染色。可以發(fā)現(xiàn)，LiveReceptor AMPAR的染色圖像和使用了抗GluA2抗體的染色圖像基本一致。

觀察組織深部

將切片培養(yǎng)的小鼠大腦使用LiveReceptor AMPAR標(biāo)記后，固定組織，以抗GluA2/3抗體進(jìn)行免疫染色。x-y平面圖像中，二者基本一致，但是從黃線部分的x-z斷面可以發(fā)現(xiàn)，抗體組織滲透性低，只能染色切片表面。然而因?yàn)長iveReceptor AMPAR滲透到了組織深處，所以能夠標(biāo)記組織深層的AMPAR。（黑箭頭：切片上端，白箭頭：切片下端）。

通過FRAP分析行為分析AMPAR

用LiveReceptor AMPAR標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性AMPAR并通過FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）法分析細(xì)胞膜上的AMPAR運(yùn)輸速度。可觀察到熒光迅速恢復(fù)的情況。

Recovery ratio：16%，diffusion coefficient：0.090 μm²s^-1

利用藥劑處理觀察突觸可塑性

使用LiveReceptor AMPAR標(biāo)記培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞后，用NMDA（50 μM）處理10 min并使用化學(xué)性LTD（Long-term depression；長時程抑制）誘導(dǎo)。在LTD誘導(dǎo)條件下，可觀察到樹突棘中標(biāo)記AMPAR的數(shù)量明顯減少。

拮抗抑制物質(zhì)探索性篩選

A：由于LiveReceptor AMPAR使用AMPAR特異性配體進(jìn)行標(biāo)記，因此可用于探索與AMPAR配體拮抗的抑制物質(zhì)和拮抗

A：劑（competitive antagonist）。

A：可在細(xì)胞、組織中確認(rèn)，LiveReceptor的標(biāo)記顯著收到AMPAR特異性抑制物質(zhì)NBQX抑制。

B上部分：AMPAR大量表達(dá)細(xì)胞，B下部分：組織