可用于活細(xì)胞的GST活性檢測探針

DNs-Rh ＜Cell-based GST Activity Assay Reagent＞

DNs-Rh是可以在活細(xì)胞中觀察Glutathione S-transferase（GST）酶活性的熒光探針。由于可以根據(jù)GST活性發(fā)出綠色熒光，可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)GST的活性。GST亞家族跨度廣泛，可以實(shí)現(xiàn)總GST活性的可視化。

※本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 理學(xué)研究科 阿部洋教授的研究成果商品化。

※本產(chǎn)品僅供科研，嚴(yán)禁用于科研以外用途。

DNs-Rh具有細(xì)胞膜透過性，隨著細(xì)胞內(nèi)GST酶活性改變而產(chǎn)生綠色熒光。通過顯微鏡或流式細(xì)胞儀定量熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)GST活性的相對(duì)定量。

◆GST及其活性檢測方法

Gluthathione S-Transferase（GST）家族廣泛存在于細(xì)菌及動(dòng)植物中，細(xì)胞內(nèi)的疏水性外源物質(zhì)（xenobiotics）被添加到gluthathione（GSH）中，具有轉(zhuǎn)換為GSH綴合物（GSH-conjugate）的活性。GSH綴合物通過MRP（multidrug resistance-associated protein）運(yùn)輸積極地排出細(xì)胞外，存在去除異物的機(jī)制。因此，GST可以作為排出具有潛在細(xì)胞毒性的外源性物質(zhì)的解毒因子而發(fā)揮作用。

另一方面，由于大多數(shù)的抗癌劑等醫(yī)藥品也是通過GST轉(zhuǎn)換為GSH綴合物排出細(xì)胞外，GST作為耐藥因子具有削弱藥效的負(fù)面效果。尤其是隨著癌癥的惡化特定的GST同種型（GSTP₁）的表達(dá)量增強(qiáng)，癌細(xì)胞獲得了強(qiáng)耐藥性。

GST既是異物代謝和解毒作用因子，也具有耐藥性因子的作用。因此，需要合適的檢測細(xì)胞內(nèi)GST活性的技術(shù)，但傳統(tǒng)方法僅限于in vitro 的活性檢測，缺少在活細(xì)胞內(nèi)觀察活性的方法。

名古屋大學(xué)阿部洋教授及其研究人員們開發(fā)的DNs-Rh是細(xì)胞膜透過性的化合物，是一種可以根據(jù)GST酶活性產(chǎn)生綠色熒光的GST活性應(yīng)答探針。因?yàn)榭梢杂糜诨罴?xì)胞，進(jìn)行各類細(xì)胞的GST活性的定量化和刺激依賴性的GST活性的監(jiān)測，可以用于傳統(tǒng)方法無法實(shí)現(xiàn)的基于細(xì)胞水平的抑制劑的開發(fā)等的各種應(yīng)用。

GST作用示意圖

GST活性檢測用探針的比較

◆詳細(xì)原理

DNs-Rh是在Rhodamine110上添加2個(gè)GST基質(zhì)2,4- dinitrobenzene sulfonamide（DNB）的化合物，呈消光狀態(tài)。DNB基質(zhì)通過GST轉(zhuǎn)換為GSH綴合體，Rhodamine 110釋放出來并發(fā)出綠色熒光（激發(fā)／熒光 = 496 / 520 nm）。DNs-Rh最初開發(fā)作為檢測體內(nèi)硫醇的試劑^1），但后來卻被發(fā)現(xiàn)其也能高效用作GST活性的檢測試劑^2）。與硫醇應(yīng)答相比，GST應(yīng)答性更強(qiáng)，現(xiàn)在我們期待DNs-Rh能成為活細(xì)胞用的GST活性檢測探針^4）。

原理示意圖

◆參考文獻(xiàn)

◆特點(diǎn)

●　根據(jù)GST活性釋放rhodamine110產(chǎn)生綠色熒光（激發(fā)/熒光=496/520 nm）。

●　具有細(xì)胞膜通透性，只需添加至培養(yǎng)基即可使用。

●　已確認(rèn)與各種GST家族具有交叉反應(yīng)性

◆應(yīng)用實(shí)例

熒光光譜（反應(yīng)前后）

向GSTP₁重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）30分鐘后，測定激發(fā)光為490 nm時(shí)的熒光光譜。僅在GSH / GSTP₁存在時(shí)觀察到了Em_max 520 nm附近的熒光。

熒光光譜

GST in vitro活性檢測

向GSTP₁重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）觀察綠色熒光強(qiáng)度（Ex / Em 490 / 520 nm）隨時(shí)間的變化，縱軸將1 μM Rhodamine 110溶液的熒光強(qiáng)度設(shè)為100%。GST存在時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)（GSH（＋）/ GST（＋））在約30分鐘左右的時(shí)候熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，約55%的探針轉(zhuǎn)換成Rhodamine，相對(duì)的，在GSH（＋）/ GST（?）的條件下，可以觀察到GSH稍微有所增加，但是Rhodamine的轉(zhuǎn)換率只有3%。

※ 正如原理所述，DNs-Rh與硫醇化合物反應(yīng)甚微。與GST存在時(shí)相比反應(yīng)明顯較弱，但是也有可能經(jīng)過幾個(gè)小時(shí)的長時(shí)間反應(yīng)使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，因此建議在反應(yīng)30~60分

※ 鐘左右后即刻進(jìn)行觀察。

活細(xì)胞熒光測定

培養(yǎng)細(xì)胞中的GST活性測定

向HeLa細(xì)胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，孵育30分鐘后用熒光顯微鏡（Ex 480 / Em 535 nm）進(jìn)行觀察。添加1 mM的不可逆性抑制物質(zhì)CNBSF（#FDV-0031）作為前處理，反應(yīng)15分鐘。通過DNs-Rh 從細(xì)胞內(nèi)觀察到 Rhodamine 110 的綠色熒光，但是用抑制物質(zhì) CNBSF 進(jìn)行前處理時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱。

※ 成像注意：本試劑是通過觀察GST釋放出來的rhodamine 110在細(xì)胞內(nèi)的分布，雖然可以基于熒光強(qiáng)度觀察GST的相對(duì)活性強(qiáng)度，但不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)GST定位的可視化。

培養(yǎng)細(xì)胞熒光成像

流式細(xì)胞術(shù)定量GST活性

左：向K562細(xì)胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，5、60、180分鐘后用流式細(xì)胞儀檢測（Ex / Em = 488 / 525 nm）。

左：可以觀察到熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化增強(qiáng)。

右：向K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，60分鐘后用流式細(xì)胞儀檢測（Ex / Em = 488 / 525 nm）。

右：與K562細(xì)胞相比，每個(gè)HL60細(xì)胞都顯示出更高的GST活性。

流式細(xì)胞儀檢測

※ 本頁面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。