高存活率細胞凍存液

CryoScarless^® DMSO-Free

CryoScarless^® DMSO-Free 是一款不含蛋白和 DMSO，適用于多種細胞的細胞凍存液。各種細胞在解凍后具有很高的培養活率，且維持了干細胞的多分化性（未分化狀態）。

◆關于含有DMSO凍存液的問題

DMSO作為普通細胞冷凍保護成分常被添加到凍存液中，但同時也是對人體有害的成分，且極易被皮膚吸收。除具有細胞毒性外，如同下列論文所述，是影響細胞分化的因子之一。因此，為獲得更精確的實驗結果，無DMSO的細胞保存是必須的。

● 使用DMSO將人骨髓白血病細胞株 HL-60 分化為粒細胞。¹

● 使用DMSO將小鼠間充質干細胞分化為心肌細胞。 ²

● 使用含有DMSD的凍存液凍存人ES細胞發現未分化標記Oct-4的表達降低。 ³

參考文獻

1. Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

2. Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

3. Katkov, I. I., et al., Cryobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆特點

● 不含血清和蛋白，因此不受白蛋白和球蛋白等蛋白的影響。

● 不受DMSO毒性和蛋白影響，可安全且高活率地凍存細胞。

● 大部分細胞在凍存后復蘇，存活率可達90%以上。

● 已有人/小鼠的正常細胞、腫瘤細胞株、干細胞等各種細胞的凍存應用。

● 凍存后可維持干細胞的分化性能。

● 同樣適用于無血清培養。

● 經無菌測試確認不含細菌、真菌與支原體污染。

● 本產品可在４°C下長期保存。（有效期２年）。 

※　使用臺盼藍處理CryoScarless保存的細胞時，請務必清洗細胞。

◆應用實例１

大鼠間充質干細胞分化能力

確認使用本產品凍存的大鼠間充質干細胞在復蘇后的分化能力，并與未凍存組以及10% DMSO保存的細胞進行比較。結果顯示，使用本產品凍存的細胞皆維持良好的分化性能。

大鼠間充干細胞的存活率

檢測使用本產品凍存（１周）的大鼠間充質干細胞在復蘇后的存活率以及 6 h后的存活率，并與10% DMSO保存的情況進行比較。本產品無論是在剛復蘇（0 h），還是貼壁后（6 h）皆顯示更高的存活率。

◆應用實例2

使用 CryoScarless^® DMSO-Free 簡單凍存后的小鼠 ES 細胞

實驗方法：

將小鼠 ES 細胞（FKHR＋/＋）在明膠包被的96孔板上于37°C培養48 h后，進行簡單地凍存。吸走培養基并用PBS清洗，然后分別添加10%DMSO/培養基，或CryoScarless^® DMSO-Free，在-80°C下保存。24 h后迅速復蘇，添加加熱至37°C的培養基，在37°C下繼續培養。6 h后使用光學顯微鏡觀察相襯圖像。

結果：

可觀察到在10%DMSO/培養基中保存的小鼠ES細胞在復蘇后活細胞減少（左圖），而在 CryoScarless^® DMSO-Free 中保存的小鼠ES細胞狀態得到改善，可觀察到大部分的活細胞。

討論：

在對多個轉基因克隆的培養板一起進行凍存時（簡易凍存），使用CryoScarless^® DMSO-Free 更加方便。利用 CryoScarless^® DMSO-Free 進行凍存，存活細胞更多，更易于未分化小鼠ES細胞的傳代培養（在一定細胞密度下每２天傳代一次），并可順利進行分化實驗。

數據提供

熊本大學發育醫學研究所 干細胞部門 組織干細胞領域 田村潔美老師

小川峰太郎老師（組織干細胞領域教授：中間），田村潔美老師（右起2）與研究室成員

◆應用實例３

對于人牙髓來源間充質干細胞的體內實驗，CryoScarless^® DMSO-Free 擁有更出色的凍存能力

日本牙科大學生命牙學部 發育、再生醫科講座 中原貴教授

生命牙科學講座 望月 真衣 助教

Establishment of xenogeneic serum-free culture methods for handling human dental pulp stem cells using clinically oriented in-vitro and in-vivo conditions.

Stem Cell Research & Therapy,, 9：25, (2015).

背景

由于再生醫學不斷普及，因此急需確立可安全地培養從患者獲得的間充質干細胞的方法。近年來，通過牙科治療從拔牙的牙組織（牙髓）中獲得的間充質干細胞，顯示比骨髓干細胞高3~4倍的高增殖性，且沒有伴隨染色體異常的細胞變化。而且牙髓干細胞擁有與骨髓干細胞相同的多分化性能。由于在體外培養可大量增殖，靈活利用低癌變和成瘤風險的牙髓干細胞，對于確保醫療安全性的再生醫學來說是一個ji具吸引力的選擇。

作為再生醫學中bi不可少的"細胞凍存"，已經證明CryoScarless^® DMSO-Free（BioVerde公司）是一款優秀的細胞凍存液。換言之，使用該細胞凍存液凍存的人牙髓干細胞擁有與未經凍存培養的牙髓干細胞相同的增殖能與多分化能力，且未發現染色體異常。

本文著眼于牙髓干細胞活躍的增殖能力，并證實了CryoScarless^® DMSO-Free不會影響細胞增殖能力。

方法及結果

從20~37歲成人拔下來的智齒分離牙髓細胞并進行無血清培養，培養至傳代數為1時使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存。3個月后再次培養凍存的細胞，傳代數到3時進行以下的細胞評價。同時，對未經凍存的牙髓細胞也進行了相同的評價。

使用相差顯微鏡觀察細胞形態，確認紡錘形的成纖維細胞形態沒有發生變化（圖-1）。根據增殖曲線分析的結果，經過12天的培養，呈現一致的細胞增殖模式，兩者間在統計學上的沒有顯著差異（圖-2）。另外，通過Bromodeoxyuridine（BrdU）進行細胞分裂能力分析的結果顯示，可觀察到對數生長期內大量的BrdU陽性細胞，細胞數在統計學上沒有顯著差異（圖-3）。

圖-1 人牙髓干細胞的相差顯微鏡圖像

無論CryoScarless^® DMSO-Free凍存（左）還是未經凍存（右）的細胞都呈現出相同的成纖維細胞樣形態。

圖-2 人牙髓干細胞增殖曲線分析

細胞培養期間，未發現兩者在統計學上的顯著差異。

圖-3 人牙髓干細胞在對數生長期內的BrdU分析

可觀察到大部分細胞攝入BraU（綠）（左），未發現兩者的BraU陽性細胞數在統計學上的顯著差異（右）。

結論

除了本文中報告的細胞增殖能力評價之外，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細胞不僅維持了成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞的多分化能力，也能維持向免疫缺陷小鼠的皮下移植并引起硬組織形成的能力。并且該產品并不影響干細胞的特性。

另外，值得注意的是，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細胞即使長期培養至傳代數為10后仍然保持染色體的二倍體和正常核型，大量培養的細胞中也沒有發現染色體異常。

在再生醫學中bi不可少的"細胞凍存"中，作為冷凍保護劑使用的Dimethyl sulfoxide（DMSO）可能會有細胞毒性和引起意外的細胞分化，因此，我們十分期待能夠確立一個像該產品一樣的無DMSO的細胞凍存體系。

本報道中使用易于獲得的牙髓來源間充質干細胞，研究了CryoScarless^® DMSO-Free對干細胞特性的影響，并確認了使用該產品凍存的細胞與未經凍存的牙髓干細胞擁有相同的細胞特性。因此，CryoScarless^® DMSO-Free在間充質干細胞基礎研究以及臨床前研究，甚至是將來的再生醫學領域中，有望成為一款可以提供安全且高預測性數據和治療成果的細胞凍存液。

中原貴教授（前排右），望月真衣助教（前排左）與研究室成員

◆實際應用的細胞和凍存效果

* -80°C凍存3個月，復蘇后24 h

◆操作方法概要

1. 將培養細胞放入離心管，離心并去掉上清。

2. 按照5×10⁵～5×10⁶ cells/mL添加本產品，并制成細胞懸液，每個凍存管分裝1 mL。

3. 放入－80℃超低溫冰箱中凍存。

4. 將在上一步中保存的細胞放入37°C恒溫水浴槽中，快速晃動使細胞解凍，融化后放入適當的培養基（10 mL）中并離心清洗。

※長期保存請置于液氮罐中保存。