蛋白聚集小體檢測試劑盒

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit

◆原理

聚集小體（Aggresome）是由一群不正常堆疊在一起的蛋白質所形成的包涵體（Inclusion Bodies）。聚集小體的出現往往也表明細胞正處于某種應激狀態，比如高溫、病毒感染、活性氧自由基攻擊等。聚集體通常是響應細胞應激而形成，并通過分離錯誤折疊的蛋白質提供細胞保護機制，最終導致它們被自噬清除。此外，蛋白質聚集體的形成是多種人類疾病的標志，例如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、肌weisuo側索硬化癥或酒精性肝病。

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT^® 是一種分子轉子染料，在溶液中沿著單個中心鍵的自由分子內旋轉可防止熒光產生。當它特異地插入到錯誤折疊和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四級結構中，旋轉受到抑制并導致發出強烈的熒光。

PROTEOSTAT^® 聚集小體檢測試劑盒提供了一種快速、特異、定量的方法來標記細胞中的聚集小體，且無需進行人工蛋白定點突變。PROTEOSTAT^® 染料已在廣泛的條件下對多種小分子調節劑進行驗證，適用于具有治療價值的化學物的篩選。此外，本試劑盒還適用于多重免疫熒光，以在自噬和聚集體形成的背景下研究您的目標分子。

◆試劑盒組成

 ◆特點

●　提供基于細胞的靈敏的藥物反應性測定，以在真實的細胞環境中識別與神經退行性疾病相關的抑制劑

●　可靠且簡單的檢測，不需要非生理性蛋白質突變或基因工程細胞系

●　作用條件廣泛，適用于篩選具有潛在治療價值的小分子化合物

●　已進行優化以兼容免疫染色

●　可通過流式細胞術輕松量化聚集體和相關包涵體

●　可用于神經退行性疾病、肝病、毒理學研究等的研究 

 ◆案例?應用

■　應用實例 1：流式細胞術檢測聚集小體

流式細胞術的分析：Jurkat細胞在37°C下用 0.2% DMSO對照或用5 µM MG-132誘導過夜。處理后，將細胞固定并與PROTEOSTAT^® 染料一起孵育，無需洗滌即通過流式細胞術在FL3通道中使用488 nm激光進行分析。在 MG-132處理的細胞中，紅色熒光信號增加約3倍。所描述的測定允許評估蛋白質聚集的影響。

■　應用實例 2：PROTEOSTAT^® 染料與熒光染料的應用

熒光顯微鏡：含有蛋白聚集體的HeLa細胞，用 5 µM MG-132蛋白酶體抑制劑（右）處理12小時，通過 PROTEOSTAT^®（紅色）檢測并用Hoechst 33342復染。左側的為未經處理的對照。

熒光顯微鏡：含有蛋白聚集體的HeLa細胞，用 5μM MG-132蛋白酶體抑制劑處理12小時，通過PROTEOSTAT^®聚集體染料（左上）檢測，顯示與熒光素-p62抗體（右上）和復合圖像（中下）的共定位

■　應用實例 3：不同攪拌速率對蛋白聚集的影響

使用本產品檢測后，可知攪拌速度越快，蛋白聚集程度越大。

■　應用實例 4：蛋氨酸氧化可抑制蛋白聚集

藍色曲線為對照，沒有攪拌；在攪拌速度在300 rpm下， 綠色曲線與紅色曲線分別表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情況。

使用本產品檢測后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

■　應用實例 5 ：內質網應激相關細胞自噬產生蛋白聚集小體

分別25，50，75 mmCQ，100 nM的thapsigargin（TG）或5mM的MG-132處理K562細胞24小時。然后在溫室下用PROTEOSTAT® （1：10,000）固定并透化細胞30min。接著在BD流式細胞儀LSR II的藍色610/20 nm的通道分析細胞（30,000）。

圖片來源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.

■　應用實例 6

K562 細胞分別使用Thapsigargin (Tg, 0.1 µM)、25、50 和 75 µM lvkui (CQ) 用試劑處理以誘導內質網應激和不wanquan自噬 24 h。使用蛋白酶體抑制劑 MG-132 (5 µM) 作為陽性對照處理24 h。將沉淀的細胞固定并透化。然后，根據制造商的說明，使用 300 µL PROTEOSTAT^® 和 1 µg/mL DAPI（用于細胞周期測定）在室溫下標記細胞30min。確定每個處理的S期的 Aggresome 傾向因子 (APF) 高于G1和高于S期的G2m的相對增加，并與對照值進行比較。與對照組相比，ER 應激誘導劑、Tg 和 50 µM CQ在S期比G1更能引起蛋白聚集體上調，但蛋白酶體抑制劑 MG-132 和 50 µM CQ 在 G2m 期比S期更顯著地下調聚集體。

圖片來源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.