可實現局部組織結構可視化的熒光染料

HistoBright

HistoBright是一種可實現雙光子激發的環境響應型膜染色熒光色素，組織滲透性優異，可根據組織的局部結構改變熒光特性，因此可實現高對比度的組織可視化。結合組織透明化處理和雙光子激光顯微鏡使用，可對組織塊進行深度觀察和空間結構分析。

※ 本產品基于高知大學和愛媛大學的研究成果，由funakoshi（株）生產并銷售。

※ 本產品僅供研究使用，研究以外的目的不可使用。

HistoBright 是一種環境響應型熒光染料，可根據溶劑的極性顯示出大范圍的波長。應用于透明化處理后的組織時，熒光會響應組織內的微環境而發生變化，隨后配合雙光子激光顯微鏡即可清晰地觀察到組織結構。

◆傳統的組織結構分析方法和新型的三維組織結構分析

傳統的組織結構分析，是通過有色染料對組織進行染色實現的，如蘇木精-伊紅（HE）染色法。而使用這些有色染料很難將組織塊整塊染色，一般需制成薄切片后再進行觀察。但薄切片很容易丟失組織結構的三維信息，因此需要制備大量切片才能重現三維結構。

HistoBright是高知大學教育研究部的仁子陽輔博士合成的新型環境響應型熒光染料（原著論文中的化合物名為PC），目前由愛媛大學醫學部的今村健志博士、村上正基博士、川上良介博士推進開發應用于三維組織結構的熒光成像染料。HistoBright會聚集在生物膜上，并根據所在局部環境不同，熒光在綠光~近紅外光的大范圍內變化。因此，當HistoBright應用于生物組織時，它可以根據組織結構誘導熒光色調的變化，從而實現高對比度觀察組織結構。由于HistoBright能夠進行雙光子激發，因此除了激光共聚焦顯微鏡外，還可以使用雙光子激光顯微鏡進行觀察。此外，配合組織透明化處理（除保持膜結構進行脫脂操作的方法外），使用HistoBright可在不破壞組織結構（不制備薄切片）的前提下觀察厚組織樣本，并通過雙光子激光顯微鏡進行深度成像，實現組織的三維結構分析。

◆特點

● 環境響應型的膜染色試劑，能根據周圍環境表現出綠光~近紅外光的熒光特性。通過區分需要檢測的熒光波長范圍，可實現高對比度的局部組織結

　構可視化。

● 配合無脫脂處理的組織透明化處理（如RapiClear（SunJin Lab公司）、LUCID等），可實現深度的組織結構三維分析。

● ※ 使用表面活性劑（Triton X-100、Tween 20等）會溶解組織中的脂質膜，可能對HistoBright的染色產生影響，因此不推薦使用。如需使用，請討論適用條件。

● 使用激光共聚焦顯微鏡鏡（推薦激發光：488 nm激光）或雙光子激光顯微鏡（推薦激發光：960 nm激光）皆可進行觀察。

● 使用雙光子激光顯微鏡觀察時，可配合使用二次諧波發生（SHG）成像，在使用本試劑的同時觀察未染色組織中的膠原纖維。

● 使用HistoBright進行染色和觀察后，可進行HE染色。

◆原著原文

Inoue, K., et al., J. Mater. Chem. B., 10(10), 1641～1649 (2022). Synthesis and photophysical properties of a new push-pull pyrene dye with green-to-far-red emission and its application to human cellular and skin tissue imaging. [PMID：35194628]

◆原理

激發/發射光譜

HistoBright是一種根據溶劑的分子極性改變熒光特性的溶劑極性響應型熒光染料（Solvatochromic fluorescent dye）。根據溶劑的極性，熒光會從綠色（低極性）向近紅外光（高極性）的范圍內大幅變動。

脂質體膜模型中熒光光譜的變化

HistoBright對脂質膜顯示高親和性，并根據脂質膜的相態表現出不同的熒光特性。與有序相Lo模型（鞘磷脂（SM）/danguchun（Chol））脂質體中的熒光最大值不同，無序相Ld模型（DOPC）脂質體中的最大波長也轉移到了約30 nm的長波長范圍，熒光量子產率也從0.72（SM/Chol）下降到了0.37（DOPC）。

※ 以上熒光光譜數據均由高知大學 仁子陽輔博士提供。

◆應用數據

使用雙光子激光顯微鏡對透明化人正常皮膚組織進行成像

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成500 μm的切片，同時進行76 h的組織透明化處理（LUCID）和HistoBright（10 μM）染色。通過雙光子激光顯微鏡，用960 nm處激光激發組織塊，分別在492 nm（SHG：青色）、500-550 nm（綠色）、560~593nm（橙色）和 593-690 nm（紅色）處分別獲取熒光圖像，制作以下4幅合成圖像。

※ 492 nm（青色）來源于組織中膠原纖維的SHG信號，而非HistoBright來源的熒光信號。

接下來，使用雙光子激光顯微鏡在Z軸方向以5 μm的間隔連續拍攝500 μm的圖像，并使用圖像分析軟件進行三維構建，以三維方式將人皮膚組織的精細結構可視化。

使用雙光子激光顯微鏡對透明化人正常皮膚組織進行三維成像

使用4% paraformaldehyde/PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成1 mm的切片，同時進行72 h的組織透明化處理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊、HistoBright（10 μM）染色和核染色（Hoechst33342）。通過雙光子激光顯微鏡，用1100 nm處激光激發組織塊，分別在＜492 nm（SHG：青色）、500~550 nm（綠色）、560~593 nm（橙色）和 593-690 nm（紅色）處分別獲取熒光圖像，制作以下4幅合成圖像。基于以上條件，在Z軸方向以5 μm的間隔連續拍攝，使用圖像分析軟件進行三維構建，將連續的數據制作成動畫。

＊ 本實驗中的組織塊固定后未進行透膜處理，直接透明化處理和染色。

重復用于HE染色

使用HistoBright染色并觀察人正常皮膚細胞組織塊，在PBS中靜置，去除透明化試劑。然后制備成薄切片，進行HE染色。已確認HistoBright染色后，仍可進行清晰的HE染色。

在激光共聚焦顯微鏡和雙光子激光顯微鏡下觀察染色

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成0.5 mm的切片，同時進行72 h的組織透明化處理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊和HistoBright（10 μM）染色。隨后，使用激光共聚焦顯微鏡鏡（左圖：激發光488 nm激光）和雙光子激光顯微鏡（右圖：激發光960 nm激光）進行觀察。雖然兩幅圖像沒有明顯區別，但在雙光子激光顯微鏡下可以觀察到雙光子激發SHG信號（膠原纖維）。

＊ 本實驗中的組織塊固定后未進行透膜處理，直接透明化處理和染色。

※ 以上圖像數據均由愛媛大學 川上良介博士提供。